E-learning 1. Úvod 1.1 Současné výzvy v moderní genomické a proteomické analýze 1.1.2. Techniky molekulární biologie pro genomovou a proteomovou analýzu

Cílem molekulární biologie je studium genomu, transkriptomu a proteomu. K tomuto účelu bylo vytvořeno mnoho laboratorních technik. Obecně lze techniky molekulární biologie rozdělit na dvě hlavní skupiny, na metody klasické a vysokopokryvné (high - throughput, high - density). Klasické metody jsou považovány za přesnější, jsou ovšem schopny analyzovat pouze omezený počet molekul v jednom experimentu. Vysokopokryvné metody mohou naopak analyzovat tisíce molekul v jednom experimentu (v jednom vzorku), ale za cenu snížené přesnosti. Standardním postupem bývá využití vysokopokryvných metod ke zkoumání potenciálních markerů a potvrzení omezeného počtu vybraných kandidátů klasickými metodami. PCR (polymerázová řetězová reakce) a její varianty (RT-PCR, real-time PCR, kvantitativní PCR,…), FISH (fluorescenční hybridizace in-situ) a její varianty (M-FISH, SKY,…), CGH (komparativní genomová hybridizace), westernový, northernový a Southernův přenos nebo gelová elektroforéza jsou jen některé ze základních klasických metod. Téměř každá vysokopokryvná metoda byla vyvinuta na základě jedné z výše uvedených klasických metod. Mikročipy používají hybridizační koncept metody southernového přenosu, arrayCGH lze považovat za vylepšení mikročipů o CGH, 2-D gelovou elektroforézu za zdokonalení jednoduché elektroforézy atd. Existuje velké množství literatury dobře popisující klasické a vysokopokryvné molekulárně biologické techniky. My se v následujícím textu zaměříme pouze na stručný popis některých z nich.

 

1.1.2.2. Vysokopokryvné metody

1.1.2.2.1. Mikročipy

Předtím než zavedeme pojem „mikročip“, definujme si výrazy, které v následujícím textu použijeme. Sonda je známá molekula navržená pro reakci se specifickou molekulou v rámci zkoumání a cíl (terč, „target“) je neznámá molekula, která bude identifikována.

Mikročip (čip, „microarray“) je vysokopokryvná technologie umožňující současné porovnání biomolekul (nukleových kyselin, proteinů, organických sloučenin nebo dokonce i tkání) mezi různými vzorky zájmu. Hlavním principem je fixace označených molekul zájmu na pevný povrch do tisíců drobných oblastí nazývaných „spoty“. Spoty jsou pravidelně uspořádány do řádků a sloupců.

Každý spot obsahuje malé množství sond – molekul určených k reakci se specifickou molekulou v rámci zkoumání. Sondy reagují s odpovídajícími označenými molekulami zájmu, čímž vytvoří komplexy a naváží tak molekuly zájmu na povrch čipu. Tyto komplexy jsou poté detekovány speciálními skenery, kde je zachycena intenzita signálu a posléze přeměněna na číselnou hodnotu. Předpokládá se, že intenzita signálu v každém spotu odpovídá množství molekul zájmu navázaných na tento spot.


Mikročipy dělíme na základě typu biologického materiálu, který má být analyzován:
 

  1. DNA mikročipy – používány pro analýzu struktury genů a jejich exprese
  2. Proteinové mikročipy - používány pro detekci proteinů
  3. Tkáňové mikročipy – umožňují souběžné srovnání nádorových vzorků
  4. Transfekční mikročipy – čipy pro analýzu funkce genů
  5. Mikročipy chemických sloučenin – sbírka organických látek používaných pro detekci proteinů vážících se na konkrétní chemické sloučeniny

V dnešní době se mikročipová analýza stala jednou z nejvíce používaných metod molekulární biologie. Ve srovnání s klasickými technikami umožňuje současné porovnání tisíců molekul (genů, proteinů,…) v jednom experimentu. Jedná se o robustní metodu používanou jak v biologickém, tak medicínském výzkumu.
Mikročipy se staly významným nástrojem v diagnostice, epidemiologii a klasifikaci nemocí. Ve fylogenetických analýzách jsou používaným nástrojem k analýze genomu druhů a umožňují tak tvorbu fylogenetických stromů. Vzhledem k širokým možnostem začínají být mikročipy používány téměř ve všech biologických a medicínských oborech.

1.1.2.2.2. Dvourozměrná (2-D) gelová elektroforéza

Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE) je technologie běžně používaná v molekulární biologii k analýze množství proteinů ve vzorku. Je založena na klasické elektroforéze, která se provádí odděleně ve dvou odlišných směrech. Cílem 2-DE je rozdělit proteiny podle jejich vlastností napříč gelem.

Princip
1. Nejprve jsou proteiny extrahovány ze tkáně zájmu. Jedním z nejdůležitějších aspektů experimentu je výběr gelu, který musí být dost porézní, aby bílkovinám umožnil pohyb. Nejčastěji se používají agarózové a polyakrylamidové gely.
2. Vzorek je umístěn na gel a proteiny začínají migrovat přes gel k opačnému konci, dokud nedosáhnou svého izoelektrického bodu, což je místo, kde je celkový náboj proteinu roven nule. Proteiny jsou separovány podle jejich naboje/ molekulové hmotnosti a poté uspořádány tak, aby pohyb v druhém směru odpovídal jejich pH gradientu.
3. Nakonec je gel obarven kvůli zjištění konkrétních spotů, které odkazují na vzorek proteinů.
4. Když jsou spoty obarveny, je zachycen obraz gelu. Intenzity pixelů spotu by měly odpovídat množství proteinu ve spotu. Poté je použit speciální software (SW) pro analýzu obrazu ke stanovení množství intenzit pixelů každého spotu. Intenzity pixelů spotu spolu s informací o umístění spotu a různých kvalit měření jsou uloženy do prvotního datového souboru.

Zvláštním typem 2-DE je 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (DIGE). V tomto experimentu jsou proteiny nejprve označeny fluorescenčním barvivem. To umožňuje umístění na gelu proteinům z různých vzorků, které se liší různými fluorescenčními barvivy. Například na jednom gelu můžeme studovat tří různé vzorky, kde jeden odpovídá kontrolní skupině a zbylé dva odpovídají odlišně léčeným skupinám.

1.1.2.2.3. Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie je analytický nástroj, který se používá pro měření molekulární hmotnosti vzorku. V proteomice je používán pro analýzu proteinů, peptidů a oligonukleotidů. Tato technologie může být považována za vysokopokryvnou, jelikož přináší informace o stovkách/ tisících peptidů z každého vzorku.  

Hmotnostní spektrometrie ve skutečnosti spíše měří hmotnostní změnu poměru iontů tvořících molekuly než přímo molekulové hmotnosti.


1.1.2.2.4. Sekvenční metody

Další generace sekvencování

  • RNAseq

Více o RNAseq:
Přehledný článek o RNAseq:
http://papers.gersteinlab.org/e-print/rnaseq/preprint.pdf

Kombinace RNAseq a ChIPseq:

http://themindwobbles.wordpress.com/2008/09/01/transcriptome-input-and-output-combined-rnaseq-and-chipseq/

  • ChIPseq

Srovnání následující generace technologií sekvencování pro charakterizaci transkriptomu
http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2164-10-347.pdf