E-learning 2. Analýza dat 2.2. Analýza vysokopokryvných genomických dat 2.2.1. DNA mikročipy 2.2.1.1. Základní princip DNA mikročipů

Základní princip DNA  mikročipů

Základní princip DNA mikročipového experimentu může být popsán v několika následujících krocích:

  1. Výroba mikročipového sklíčka: Krátké fragmenty DNA (oligonukleotidů) známé sekvence zvané sondy, navržené k reakci s cílovými DNA fragmenty vzorků zájmu, jsou imobilizovány v mikroskopických oblastech (spotech) na pevném podkladu (sklíčku). Spoty jsou na sklíčku uspořádány obvykle se stejnými vzdálenostmi ve tvaru matice desítek/stovek sloupců a desítek/stovek řádků. Sondy jsou obvykle jednořetězcové (prohlédněte si obrázek níže): 
  2. Příprava vzorku
    Nejprve se ze vzorku, který má být analyzován, vyizolují molekuly zájmu (DNA nebo mRNA). Molekula mRNA je přepsána do cDNA a amplifikována použitím RT-PCR. DNA je amplifikována pomocí PCR. Amplifikovaná DNA (cDNA) je označena fluorescenčním barvivem (nejčastěji Cy3 nebo Cy5). To se nazývá přímé značení. U nepřímého značení je nejprve reagující skupina, obvykle primární amin, včleněna do cDNA, a pak je v oddělené reakci připojeno k cDNA barvivo Cy3 nebo Cy5.
  3. Hybridizace
    Dvouřetězcová molekula DNA (cDNA) je denaturována teplotou okolo 100°C. Při této teplotě jsou vodíkové vazby, které drží komplementární páry bází a tudíž helixové řetězce pohromadě, přerušeny a šroubovice se velmi rychle odděluje do dvou samostatných řetězců. Podle specifických podmínek je denaturace DNA reverzibilní (vratná). Jednořetězcová DNA má tendenci vázat se s komplementárními řetězci, vytváří tak samostatný dvouřetězcový hybrid (duplex). Tento proces se nazývá DNA renaturace nebo hybridizace.          Fluorescenčně označené DNA (cDNA) fragmenty vzorku jsou hybridizovány se sondami na mikročipovém sklíčku. Denaturované (jednořetězcové) molekuly vzorkové DNA (cDNA) se váží k sondám s komplementárními sekvencemi, vytváří tak dvouřetězcové hybridy (jeden řetězec utvořený sondou, druhý označenou cílovou DNA). Vlastnosti fluorescenčních barviv poskytují detekci těchto komplexů za použití laserových skenerů. Laser jisté vlnové délky excituje fluorescenční barvivo přítomné v každém spotu mikročipu a barvivo emituje záření, které je zachycováno fotonásobičem. Množství emitovaného signálu je přímo úměrné s množstvím barviva ve spotu na mikročipu. Tyto hodnoty jsou získány a kvantitativně vyjádřeny na skeneru, který tak vytváří obrázek mikročipového sklíčka.
    Každé fluorescenční barvivo je excitováno podle odlišných UV vlnových délek, tato vlastnost umožňuje porovnávat dva vzorky na stejném mikročipovém sklíčku. Toho se využívá u dvoukanálových DNA mikročipů. Zde je DNA jednoho vzorku označena jedním fluorescenčním barvivem (např. Cy3, zelená barva), DNA druhého vzorku je označena jiným fluorescenčním barvivem (např. Cy5, červená barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovány na mikročipovém sklíčku, kde se kompetitivně vážou na sondách s komplementárními sekvencemi. Skener zachytí obrázek pro každý kanál (fluorescenční barvivo) individuálně a dva obrázky jsou později v procesu analýzy obrazu sloučeny dohromady.
    Následující videa znázorňují proces DNA mikročipového experimentu: MAXANIM
    YOUTUBE animace
    Následující video ukazuje princip různých typů mikročipů (včetně proteinových čipů)
    YOUTUBE rozdíly mezi čipy